Tolérance des Dommages de l’ADN

Notre projet consiste à comprendre les conséquences biologiques qui résultent de la réplication d’un génome endommagé. La présence de dommages dans l’ADN durant la réplication est la cause majeure de mutations ponctuelles, elles-mêmes à l’origine des Cancers.

 

 

 

Mécanismes de tolérance des lésions

Malgré des systèmes de réparation efficaces, il est fréquent que la fourche de réplication rencontre des lésions résiduelles. Les cellules disposent de deux stratégies de tolérance des lésions : i) la synthèse translésionnelle (TLS) voie par laquelle une ADN polymérase spécialisée insère quelques nucléotides en face de la lésion avec le risque d’introduire des mutations ; ii) la voie des contournements de dommage (Damage Avoidance : DA) qui est non-mutagène puisqu’elle repose sur des mécanismes apparentés à la recombinaison homologue avec la chromatide sœur. L’équilibre entre ces deux voies est très important puisqu’il définit le niveau de mutagenèse lors de la réplication d’un génome endommagé. Nous avons développé une nouvelle technique qui nous permet d’insérer une lésion unique en un site spécifique du chromosome bactérien. Cette approche nous permet de suivre in vivo et de manière quantitative, la répartition entre synthèse translésionnelle (TLS) et contournement des dommages (DA) dans différents fonds génétiques, afin de déterminer les gènes qui régulent l’équilibre entre ces deux voies. Nous analysons également les intermédiaires de réplication précoces qui se forment au niveau de la lésion, par des approches moléculaires (qPCR, gel d’agarose en 2D, microscopie électronique), afin de définir les mécanismes impliqués dans les voies de tolérance des lésions. Nous souhaitons adapter cette même approche aux eucaryotes.

Integration d'une lésion unique dans le chromosome. La cellule porte un site d'integration attR unique en fusion avec l'extrémité 3' du gène lacZ, à la minute 17 du chromosome d'Escherichia coli. Un vecteur portant la lésion unique ainsi que le site attL est introduit par électroporation et va être intégré par recombinaison entre les sites attL et attR grâce à l'intégrase du phage lambda qui est exprimée dans la cellule. Les intégrants sont sélectionnés sur milieu ampicilline. L'intégration au nucléotide près restaure un gène lacZ fonctionnel sur le brin endommagé, ce qui permet de visualiser les évènements de TLS sous forme de secteurs bleus, tandis que les événements de DA sont représentés par les colonies blanches.

 

La réponse aux Dommages de l’ADN chez l’Homme

La réponse aux Dommages de l’ADN chez l’Homme (DDR pour DNA Damage Response) fait intervenir un réseau d’interaction complexe de plusieurs centaines de protéines. Nous développons une approche globale pour isoler et analyser les complexes protéiques qui s’assemblent in vivo au niveau des dommages de l’ADN. Différents types de dommages de l’ADN (lésions UV, cancérogènes chimiques, pontages interbrins…) sont introduits in vitro sur des plasmides, ces plasmides endommagés sont ensuite transfectés dans des cellules en culture. Les plasmides endommagés sont sujets aux mécanismes de réparation et/ou de réplication. Après différentes périodes d’incubation, les plasmides et les complexes de réparation et/ou de réplication qui leur sont associés sont isolés et analysés par des techniques de protéomiques (DIGE, iTRAQ). La capture spécifique des plasmides qui nous servent de sonde est assurée par une nouvelle méthodologie basée sur la formation de triples hélices entre le plasmide sonde et un oligonucléotides couplé à la biotine. Cette méthodologie va être étendu à la capture de fragments de chromatine d’intérêt (CoIFI: Chromatin-of-Interest Fragment Isolation).

 

 

L'équipe

De gauche à droite : Yoshihiko Yagi, Robert Fuchs, Asako Isogawa, Shingo Fujii, Karel Naiman, Gaëlle Philippin, Luisa Laureti, Vincent Pagès