Recombinaison homologue, NHEJ et sauvegarde de l’intégrité génomique

En bref

Un défaut des systèmes de détection et de réparation des cassures double brin de l’ADN peut être à l’origine de la formation d’un cancer. Afin de mieux comprendre ce processus, notre équipe étudie les mécanismes moléculaires des deux voies de réparation de ces lésions génotoxiques: la Recombinaison Homologue et la NHEJ. D’autre part, ces systèmes de réparation permettent aux cellules cancéreuses de résister aux traitements anticancéreux basés sur la radiothérapie ou la chimiothérapie utilisant des substances comme la mitomycine C ou le cisplatine. En effet, le principe de ces traitements est d’induire la formation de cassures double brin dans l’ADN des cellules cancéreuses pour les tuer. La Recombinaison Homologue et la NHEJ sont donc des cibles de choix pour concevoir des moyens pour améliorer l’efficacité des ces traitements anticancéreux.

Notre équipe s’attache à étudier les mécanismes de réparation des cassures double-brin de l’ADN au niveau moléculaire, en particulier la recombinaison homologue et la voie de Jonction d’Extrémités Non-Homologues (NHEJ) par une combinaison d’approches bochimiques et de biologie cellulaire. Nous utilisons également des m éthodes ‘single molecule’ qui nous permettent de visualiser et de suivre le comportement dynamique des protéines impliquées dans le processus de réparation à l’oeuvre sur des molécules d’ADN isolées. Pour cela nous utilisons des pincettes optiques pour attacher et manipuler des molécules d’ADN isolées, et la microscopie à fluorescence pour observer en temps réel des protéines marquées interagir avec le substrat d’ADN.

 

En détail

L’ADN est une molécule qui est souvent endommagée. Si ces lésions ne sont pas réparées ou mal réparées, des mutations peuvent apparaître et conduire à un état d’instabilité génomique. Une cellule dans un tel état peut se mettre à proliférer anormalement et être à l’origine de la formation d’une tumeur, ou simplement être vouée à mourir. La réparation efficace des lésions est donc une nécessité majeure pour les organismes vivants. Parmi ces lésions, les cassures double-brin de l’ADN sont particulièrement dangereuses car elles peuvent induire des aberrations chromosomiques comme des translocations ou la perte d’un fragment de chromosome.

Pour contrecarrer les effets potentiellement pernicieux des cassures double-brin, nos cellules possèdent deux systèmes de réparation. Un premier système utilise la “Recombinaison Homologue” dont le cœur de la réaction est un échange de brin entre deux molécules d’ADN identiques ou quasi identiques et catalysée par la recombinasse RAD51, l’équivalent de RecA chez la bactérie. Nous savons que ce système représente un élément puissant pour protéger l’intégrité du génome mais que s’il est utilisé de manière incorrecte par la cellule, ou est perturbé et défectueux, les répercussions peuvent conduire à l’apparition de cancers comme c’est le cas pour le cancer du sein lorsque la protéine régulatrice BRCA2 est défective. L’autre système de réparation des cassures double-brin de l’ADN est la Jonction d’Extrémités Non-Homologues (ou NHEJ en anglais). Il implique un groupe de protéines effectrices distinctes du premier système, et notamment l’ADN Ligase 4 humaine et ses cofacteurs XRCC4 et XLF auxquelles nous nous intéressons directement. Ce système NHEJ joue un rôle primordial dans la réparation des cassures double-brin de l’ADN induites par les radiations ionisantes, et protège le génome des cellules humaines contre l’apparition de translocations.

Le but de notre recherche est de comprendre précisément comment ces deux systèmes de réparation fonctionnent au niveau moléculaire. Pour cela, nous étudions les activités des protéines de la réparation in vitro par la biochimie classique d’ensemble et mais aussi in vivo par des approches de biologie cellulaire. En outre, nous utilisons une approche « molécule unique » qui permet la visualisation directe en temps réel des protéines de la réparation en action sur une molécule d’ADN unique.

Nous espérons à terme pouvoir apporter, grâce à nos recherches, de nouvelles connaissances permettant d’améliorer les traitements médicaux existants en pathologie humaine ou offrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour soigner le cancer.

Figure 1

Nos derniers travaux en collaboration avec Murray Junop (McMaster University, Canada) et Kathy Meek (Michigan State University, USA) ont révélé un rôle inattendu des protéines XRCC4 (bleu) et XLF (orange) tout au début de la NHEJ en formant une super structure filamenteuse alternante capable d’exercer une activité de pontage des cassures double brin de l’ADN (Andres SN et al, 2012, Nucleic Acids Res. 40(4):1868-1878 et Roy et al, 2012 Nucleic Acids Res. 40(4):1684-1694).

A propos du Chef d'équipe

Mauro Modesti

Parcours

  • 2009 - Present : DR2 CNRS section 21
  • 2007 - 2009 : Chercheur Associé (poste rouge), IGC, CNRS, Marseille, France
  • 2004 - 2007 : Scientist, Department of Cell Biology and Genetics Erasmus Medical Center, Rotterdam, The Netherlands
  • 1999 - 2004 : Senior Postdoctoral fellow, Department of Cell Biology and Genetics, Erasmus Medical Center, Rotterdam, The Netherlands (Supervisors: Roland Kanaar and Claire Wyman)
  • 1996 - 1999 : Postdoctoral fellow, Laboratory of Molecular Biology National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA(Supervisor: Martin Gellert)
  • 1991 - 1996 : Ph.D. in Molecular Biology and Genetics, Wayne State University, Detroit, MI, USA (Supervisor: Craig N. Giroux)

     

    Principales réalisations

    Dans le champ du NHEJ

    Les travaux de Mauro Modesti ont contribute à clarifier le rôle et la régulation des protéines de réparation NHEJ XRCC4, XLF et DNA Ligase IV.

    1. Modesti, M., Hesse, J.E., and Gellert, M. (1999). DNA binding of Xrcc4 protein is associated with V(D)J recombination but not with stimulation of DNA ligase IV activity. The EMBO Journal 18, 2008-2018.
    2. Junop, M.S., Modesti, M., Guarne, A., Ghirlando, R., Gellert, M., and Yang, W. (2000). Crystal structure of the Xrcc4 DNA repair protein and implications for end joining. The EMBO Journal 19, 5962-5970.
    3. Modesti, M., Junop, M.S., Ghirlando, R., van de Rakt, M., Gellert, M., Yang, W., and Kanaar, R. (2003). Tetramerization and DNA ligase IV interaction of the DNA double-strand break repair protein XRCC4 are mutually exclusive. Journal of Molecular Biology 334, 215-228.
    4. Wang, Y.G., Nnakwe, C., Lane, W.S., Modesti, M., and Frank, K.M. (2004). Phosphorylation and regulation of DNA ligase IV stability by DNA-dependent protein kinase. The Journal of Biological Chemistry 279, 37282-37290.
    5. Mari, P.O., Florea, B.I., Persengiev, S.P., Verkaik, N.S., Bruggenwirth, H.T., Modesti, M., Giglia-Mari, G., Bezstarosti, K., Demmers, J.A., Luider, T.M., Houtsmuller AB, van Gent DC.. (2006). Dynamic assembly of end-joining complexes requires interaction between Ku70/80 and XRCC4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 18597-18602.
    6. Andres, S.N., Modesti, M., Tsai, C.J., Chu, G., and Junop, M.S. (2007). Crystal Structure of Human XLF: A Twist in Nonhomologous DNA End-Joining. Molecular Cell 28, 1093-1101.
    7. Wu PY, Frit P, Meesala S, Dauvillier S, Modesti M, Andres SN, Huang Y, Sekiguchi J, Calsou P, Salles B, Junop MS. Structural and functional interaction between the human DNA repair proteins DNA ligase IV and XRCC4. Mol Cell Biol. 2009 Jun;29(11):3163-72.
    8. Andres SN, Vergnes A, Ristic D, Wyman C, Modesti M# and Junop M#. A human XRCC4-XLF complex bridges DNA. Nucleic Acids Res. 2012 Feb;40(4):1868-1878 #Corresponding authors
    9. Roy S, Andres SN, Vergnes A, Neal JA, Xu Y, Yu Y, Lees-Miller SP, Junop M, Modesti M#, Meek K#. XRCC4's interaction with XLF is required for coding (but not signal) end joining. Nucleic Acids Res. 2012 Feb;40(4):1684-1694. #Corresponding authors
    10. Cottarel J, Frit P, Bombarde O, Salles B, Négrel A, Bernard S, Jeggo PA, Lieber MR, Modesti M and Calsou P. A Noncatalytic Function of the Ligation Complex during Nonhomologous End Joining. JCB 2012, In press

     

    Dans le champ de la Recombinaison Homologue

    Le travail de Mauro Modesti sur la recombinaison homologie a contribué à l’élucidation du rôle des protéines RAD51, RAD52, MRE11, RAD52, MUS81-EME1, BRCA2 et RAD51AP1.

    1. de Jager, M., Dronkert, M.L., Modesti, M., Beerens, C.E., Kanaar, R., and van Gent, D.C. (2001). DNA-binding and strand-annealing activities of human Mre11: implications for its roles in DNA double-strand break repair pathways. Nucleic Acids Research 29, 1317-1325.
    2. Ristic, D., Modesti, M., Kanaar, R., and Wyman, C. (2003). Rad52 and Ku bind to different DNA structures produced early in double-strand break repair. Nucleic Acids Research 31, 5229-5237.
    3. Ristic, D., Modesti, M., van der Heijden, T., van Noort, J., Dekker, C., Kanaar, R., and Wyman, C. (2005). Human Rad51 filaments on double- and single-stranded DNA: correlating regular and irregular forms with recombination function. Nucleic Acids Research 33, 3292-3302.
    4. Hanada, K., Budzowska, M., Modesti, M., Maas, A., Wyman, C., Essers, J., and Kanaar, R. (2006). The structure-specific endonuclease Mus81-Eme1 promotes conversion of interstrand DNA crosslinks into double-strands breaks. The EMBO Journal 25, 4921-4932.
    5. Modesti, M. (#), Budzowska, M., Baldeyron, C., Demmers, J.A., Ghirlando, R., and Kanaar, R. (2007). RAD51AP1 is a structure-specific DNA binding protein that stimulates joint molecule formation during RAD51-mediated homologous recombination. Molecular Cell 28, 468-481. (#) Mauro Modesti corresponding author and organize “Recommended” article by the Faculty of 1000 Biology
    6. Holthausen JT, van Loenhout MT, Sanchez H, Ristic D, van Rossum-Fikkert SE, Modesti M, Dekker C, Kanaar R, Wyman C. Effect of the BRCA2 CTRD domain on RAD51 filaments analyzed by an ensemble of single molecule techniques. Nucleic Acids Res. 2011 Aug;39(15):6558-6567.

     

    Dans le champ des analyses ‘single molecule’

    En collaboration avec les biophysiciens Erwin Peterman et Gijs Wuite (VU Amsterdam, Pays-Bas) et Cees Dekker (TU Delft, Pays-Bas), Mauro Modesti a participé au développement d’approches ‘single molecule’ appliquées à l’étude des mécanismes de réparation de l’ADN.

    1. van Mameren J, Modesti M, Kanaar R, Wyman C, Wuite GJ, Peterman EJ. Dissecting elastic heterogeneity along DNA molecules coated partly with Rad51 using concurrent fluorescence microscopy and optical tweezers. Biophys J. 2006 Oct 15;91(8):L78-80
    2. Modesti M#, Ristic D, van der Heijden T, Dekker C, van Mameren J, Peterman EJ, Wuite GJ, Kanaar R, Wyman C. Fluorescent human RAD51 reveals multiple nucleation sites and filament segments tightly associated along a single DNA molecule. Structure. 2007 May;15(5):599-609.#Correponding author
    3. van der Heijden T, Seidel R, Modesti M, Kanaar R, Wyman C, Dekker C. Real-time assembly and disassembly of human RAD51 filaments on individual DNA molecules. Nucleic Acids Res. 2007;35(17):5646-57.
    4. van der Heijden T, Modesti M, Hage S, Kanaar R, Wyman C, Dekker C. Homologous recombination in real time: DNA strand exchange by RecA. Mol Cell. 2008 May 23;30(4):530-8.
    5. van Mameren J, Modesti M, Kanaar R, Wyman C, Peterman EJ, Wuite GJ. Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension. Nature. 2009 Feb 5;457(7230):745-8.
    6. van Mameren J, Gross P, Farge G, Hooijman P, Modesti M, Falkenberg M, Wuite GJ, Peterman EJ. Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Oct 27;106(43):18231-6.
    7. Modesti, M. Fluorescent labeling of proteins. Methods Mol Biol. 2011;783:101-120.
    8. Holthausen JT, van Loenhout MT, Sanchez H, Ristic D, van Rossum-Fikkert SE, Modesti M, Dekker C, Kanaar R, Wyman C. Effect of the BRCA2 CTRD domain on RAD51 filaments analyzed by an ensemble of single molecule techniques. Nucleic Acids Res. 2011 Aug;39(15):6558-6567.

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