Anticorps Thérapeutiques et Immunociblage

Comprendre les mécanismes par lesquels le système immunitaire influence le développement et la progression du cancer est une question centrale en immunologie.

Comment peut-on bloquer les mécanismes immuno-suppresseurs induits par les cancers de manière efficace et booster les propriétés anti-tumorales naturelles ou activées par traitement thérapeutiques du système immunitaire sans provoquer de réactions auto-immunes néfastes ? Cette question est probablement la plus pressante et la plus importante dans la domaine de l’immunité anti-tumorale.

Nous mettons en œuvre une approche innovante basée sur l’utilisation de domaines d’anticorps monovalents et de phage display afin de générer des nouvelles molécules capables de stimuler les principaux effecteurs du système immunitaire : les cellules NK par l’intermédiaire des protéines CD16 et NKGD2 et les cellules T par l’intermédiaire du complexe protéique CD3, de façon ciblée pour une cellule cible spécifique dans son microenvironnement.

La mise au point de techniques de détection du cancer du sein non-invasives basées sur des biomarqueurs est urgente puisque le risque de récurrence, de morbidité et de mortalité est étroitement associé au stade de développement de la maladie au moment de l’opération chirurgicale primaire.

L’existence de marqueurs pertinents et des anticorps correspondants est un élément essentiel de la mise au point d’outils diagnostiques et thérapeutiques. Nous avons mis au point une procédure de sélection par phage display originale qui permet d’isoler des domaines d’anticorps monovalents (sdABs) dirigés contre de nouveaux marqueurs tumoraux. Grâce à ces nouveaux sdAbs anti-tumoraux, nous mettons au point de nouvelles approches pour le diagnostic et/ou l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.

Les sdAbs possèdent des caractéristiques originales qui en font de bons anticorps neutralisants.

Étant constitués d’un domaine immunoglobuline isolé, ces fragments d’anticorps de 13kDa peuvent se lier à des épitopes enfouis qui sont inaccessibles aux anticorps conventionnels. De plus, les sdAbs sont très stables et restent fonctionnels en milieu réducteur empêchant la formation des ponts disulfides qui sont indispensables à la formation des domaines immunoglobuline conventionnels.

Nous exploitons ces propriétés pour générer des sdAbs capables de bloquer des épitopes fonctionnels et donc conservés de la protéine Env de HIV-1 ou encore des anticorps intracellulaires capables de neutraliser la protéine de régulation Nef de HIV-1 dans des cellules infectées. Nous utilisons des approches similaires basées sur l’utilisation d’anticorps intracellulaires pour mettre au point de nouvelles thérapies anti-cancéreuses.

Inactiver les mécanismes de tolérance induits par les tumeurs : stimulation de l’immunité anti-tumorale des cellules NK et des cellules T

Nous savons maintenant que le système immunitaire a un rôle à double tranchant dans le cancer : il peut réduire la croissance tumorale en détruisant des cellules cancéreuses ou en bloquant leur expansion, mais il peut aussi favoriser la progression tumorale soit par sélection de cellules tumorales mieux adaptées à un processus de sélection Darwinien, soit en créant des conditions qui favorisent l’expansion tumorale au sein du microenvironnement tumoral.

L’infiltration de tumeurs par des cellules T CD4+ et CD8+productrices d’IFN-gamma, et la présence de cytokines telles que l’IFN-gamma et le TNF-alpha qui favorisent le contrôle de la progression tumorale, a été associée à un pronostique favorable pour les patients pour de nombreux cancers. De façon remarquable, le type et la densité des cellules T infiltrées dans une tumeur sont des indicateurs pronostiques plus puissants que les critères pathologiques qui été précédemment utilisés pour déterminer le stade de développement d’une tumeur, meilleurs encore que la corrélation du stade de progression de la maladie avec l’expression d’oncogènes.

De la même façon, de nombreux travaux indiquent que les cellules NK et leurs récepteurs jouent un rôle dans le processus d’immunosurveillance des tumeurs spontanées, y compris chez l’homme. En effet, plusieurs études ont montré qu’une faible activité lytique NK est associée à un risque de cancer accru. Cependant, les tumeurs en phase de croissance ont acquis des mécanismes d’échappement au contrôle des cellules NK comme la perte de l’expression de surface de ligands NKG2D qui fonctionnent normalement comme leurres pour les récepteurs d’activation à la surface des cellules NK. Le microenvironnement des tumeurs en phase de croissance peut aussi induire une réduction du niveau d’expression des récepteurs d’activation et une augmentation du niveau d’expression de récepteurs inhibiteurs des cellules NK infiltrées dans la tumeur, ce qui bloque leur fonction cytolytique.

Ces observations ont conduit à l’émergence du concept d’immunoédition qui part du postulat que des cellules tumorales qui échappent aux indicateurs cliniques sont constamment éliminées par le système immunitaire. Dans de rares cas, certaines cellules tumorales survivent, ce qui crée un nouvel équilibre croissance/lyse (phase d’équilibre) et qui conduit à la sélection de cellules capables d’échapper au contrôle du système immunitaire en provoquant un état d’immunosuppression dans le microenvironnement tumoral. Ces cellules tumorales peuvent ensuite entrer dans la phase d’échappement, ce qui conduit à un stade de la maladie cliniquement détectable.

Ce microenvironnement hostile est créé par le processus de tumorogenèse qui génère un état d’immunosuppression, un blocage aux fonctions immunitaires et à l’immunothérapie. Notre objectif est donc de booster l’état d’activation des cellules effectrices du système immunitaire infiltrées dans le microenvironnement tumoral.  Pour cela, nous utilisons une forme originale d’anticorps recombinants bispécifiques basé sur l’utilisation de sdAbs de lama fusionnés, sans protéine de liaison, et dans la bonne orientation,  avec les domaines d’hétérodimérisation C-kappa de l’IgG1 humains. Ces bsFabs sont extrêmement stables et peuvent être produits de façon efficace dans E. coli.

 

Nous utilisons des bsFabs pour activer les cellules T de façon polyclonale et MHC-indépendante de CD3, ou pour activer des cellules NK par le biais de récepteurs naturels impliqués dans leur activation (NKG2D) ou en mode anticorps-dépendant (CD16).

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Mise au point de nouveaux outils de diagnostic et de nouvelles cibles thérapeutiques dans le cancer du sein

Les sdAbs peuvent être produits de façon efficace par immunisation de lamas par différents types d’antigènes y compris par des lignées cellulaires tumorales humaines ou des biopsies humaines (voir ci contre lien vers la plateforme nanobodies). Des bibliothèques phage display peuvent être construites puisque leur production ne nécessite pas d’étape combinatoire (contrairement aux fragments Fv isolés).

Nous avons construit plusieurs bibliothèques à partir de biopsies humaines. Une procédure de phage display innovante appelée « Masked Selection » a été mise au point pour favoriser la sélection de marqueurs spécifiques des tumeurs ou de marqueurs surexprimés à partir de lysats cellulaires (à des fins de diagnostic) ou de cellules tumorales intactes (à des fins thérapeutiques).

Plusieurs sdAbs spécifiques de tumeurs ont été isolés et utilisés pour générer des batteries de billes multiplex, qui permettent une détection très sensible et la concentration de plusieurs marqueurs tumoraux à partir de petites quantités d’échantillons. L’identité des nouveaux marqueurs tumoraux peut être déterminée par la combinaison d’analyses par immunoprécipitation et par spectrométrie de masse.

Ces approches ont été appliquées au cancer du sein mais elles peuvent également être appliquées à d’autres types de cancer.

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Neutralisation d’HIV-1 par des anticorps à domaine isolé anti-Env et anti-Nef

La neutralisation par anticorps constitue un mécanisme efficace de résistance de l’hôte à de nombreux pathogènes. Lors d’une infection par HIV-1, la plupart des anticorps produits par le patient sont spécifiques de la protéine  Env qui interagit avec le récepteur CD4 et avec les co-récepteurs CCR5 ou CXCR4. Pour échapper à cette réponse immunitaire, HIV-1 a acquis de nombreuses stratégies y compris une hypervariabilité de séquence, la protection d’épitopes sensibles par perte de carbohydrate, ou par changement de conformation ou par entropie. Par conséquent, la réponse anticorps neutralisante à une infection par HIV-1 est faible et étroite, et peu d’anticorps monoclonaux à effet neutralisant ont été isolés à ce jour.

Malgré cette complexité, la protéine Env d’HIV-1 garde des motifs conservés essentiels à la liaison aux récepteurs et co-récepteurs CD4 et CCR5. Mais malheureusement, ces épitopes sont enfouis et protégés par une forte glycosylation et ne peuvent donc as aisément être ciblés par des anticorps conventionnels.

De part leur petite taille, les sdAbs de lama peuvent se lier à des épitopes qui ne sont pas accessibles aux anticorps classiques. Nous prenons avantage de cette propriété pour générer des fragments d’anticorps neutralisants dirigés contre CD4 ou des sites de liaison de co-récepteurs de la protéine Env d’HIV-1. Plusieurs stratégies de sélection sont utilisées pour isoler des anticorps à domaine isolé qui présentent de larges propriétés neutralisantes

Les sdAbs étant également caractérisés par leur extrême stabilité, ils restent fonctionnels quand ils sont produits en milieu réducteur, dans des cellules eucaryotes. Grâce à ces propriétés, les sdAbs se comportent comme des anticorps intracellulaires (intrabodies) et peuvent neutraliser leur cible dans des cellules vivantes.

Nous utilisons cette propriété originale pour fabriquer des intrabodies qui ciblent la protéine Nef d’HIV-1, une protéine qui est exprimée dans les premières phases de l’infection et qui protège les cellules infectées de l’attaque des cellules T cytolytiques et accroit ainsi l’infectivité du virus. Ce sdAb est capable de bloquer la plupart des activités neutralisantes, y compris la réduction du niveau d’expression de CD4, l’augmentation de l’infectivité, et le blocage de la maturation des cellules T CD4+ T dans le thymus.

Nous avons étendu le champ d’application de ce sdAb en le fusionnant à un domaine SH3 qui cible un autre épitope de la protéine Nef. Cette molécule que l’on a appelé Neffin est capable de bloquer toutes les fonctions de Nef, y compris la diminution de l’expression de MHC-1 et les effets d’inhibitions de la  phagocytose. Cette construction représente un outil efficace pour mettre au point de nouvelles stratégies de ciblage de la protéine Nef.

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L'équipe

De gauche à droite : Elise, Rachid, Daniel, Patrick, Benjamin, Damien, Marc, Klervi, Lauren, Stéphane, Brigitte, Corinne